如何利用流式进行细胞凋亡（Cell Apoptosis）分析

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)是一种细胞膜活性物质，正常细胞中，其位于细胞膜脂质双层内侧,在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。

凋亡早期：磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI（与DNA结合）染色为阴性。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可以与凋亡早期外翻的磷脂膜(PS)结合。

凋亡中晚期：磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜被破坏，Annexin V和PI分别与磷脂酰丝氨酸和DNA结合。

坏死细胞：没有细胞膜，PI与DNA结合。

一、实验前准备：

FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I

二、样本设置：

1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。

2. 阴性对照：未诱导的，Annexin V/PI双染，细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。

3. 单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿。

4. 单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿。

三、实验步骤：

1.收集细胞，用冷的PBS洗两次，之后用1X binding buffer （PBS稀释）重悬细胞（1X10^6/ml）;

2.吸取100ul细胞悬浮液放入新的离心管中，：1）PITC和PI都不染的细胞 2）只染FITC Annexin V(no PI) 3）只染PI(no FITC Annexin) 4）都染的细胞（FITC和PI都加5ul）

3.轻轻震荡混匀，黑暗处室温（25℃）孵育15mins；

4.最后加入400ul 1X binding buffer,一个小时之内进行上机检测。

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