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EZB彩色qPCR试剂盒是专为多重实时荧光定量PCR设计的全预混体系，包含优化浓度的ROX2被动参比染料，适配ABI 7500、Bio-Rad CFX96等多品牌qPCR仪。核心优势包括：
·2×预混Master Mix：整合HotStart Taq酶、dNTPs及反应缓冲液
·高兼容性：支持SYBR Green I、EvaGreen及TaqMan探针检测
·扩增效率：标准曲线显示≥98%扩增效率(R²值>0.99)
货号：A0012-R2
包装规格：1 mL(50次反应) / 5 mL(250次反应)
ROX浓度：预混0.3X ROX2(适配多数机型光学校准需求)
适用样本：DNA(≥1 ng/μL)、cDNA(稀释比1:5-1:20)
保存条件：-20℃避光保存(避免反复冻融>5次)
有效期：生产日期起18个月
1. 反应体系配置
| 组分 | 体积（μL） |
| 2× qPCR Master Mix | 10 |
| 正向引物（10 μM） | 0.4 |
| 反向引物（10 μM） | 0.4 |
| 模板DNA | 1-5 |
| ddH₂O | 补至20 |
2. 程序设置（两步骤法）
①预变性：95℃ 3分钟（激活HotStart酶）
②循环阶段（40 Cycles）：
·95℃ 15秒（变性）
·60℃ 30秒（退火/延伸，FAM通道采集荧光）
③熔解曲线（选做）：
65℃→95℃，每0.5℃递增，驻留5秒
3. 数据判读
·Ct值阈：建议设置于荧光信号指数增长1/3处
·熔解曲线：单峰提示特异性扩增（Tm值波动≤1.5℃为正常）
1. 基因组DNA定量（人类GAPDH基因）
·模板量：10 ng DNA
·引物浓度：0.2 μM
·结果判读：Ct值＜28（3次重复CV≤1.5%）
2. 病毒RNA检测（甲流H1N1）
·反转录整合：直接使用cDNA（试剂盒兼容预混RT-qPCR体系）
·探针浓度：TaqMan探针0.5 μM
·灵敏度：检测下限达10 copies/μL
3. 细菌表达分析（大肠杆菌16S rRNA）
·抑制剂处理：添加1% BSA消除腐殖酸干扰
·梯度稀释：标准曲线R²值需≥0.995
| 问题现象 | 潜在原因 | 解决方案 |
| 扩增曲线平台期低 | 模板降解或引物二聚体 | 更换新批次引物 + DNase处理模板 |
| 阴性对照出现Ct值 | 气溶胶污染 | 启用UNG防污染系统（货号A0021） |
| 熔解曲线出现多峰 | 非特异性扩增 | 提升退火温度至62℃，缩短延伸时间 |
| ROX校正信号异常 | 分装冻融次数过多 | 新解冻试剂 + 校准仪器光路 |
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